جداسازی، خالص سازی و تعیین ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم سلولاز از باکتری bacillus subtilis dr8806

در این پژوهش، آنزیم سلولاز از سویه گرمادوست bacillus subtilis dr8806جدا شده از چشمه دیگ رستم، با استفاده از روش‏های رسوب دهی با سولفات آمونیوم و کروماتوگرافی تعویض یونی q-سفاروز خالص گردید. وزن مولکولی این آنزیم بر اساس sds-page حدود 52 کیلو دالتون محاسبه گردید. بر اساس نتایج بدست آمده، ph بهینه آنزیم، 9.5 و آنزیم در ph بین 8.5 تا 10.5 پایدار است. دمای بهینه آنزیم c° 55 است و در محدوده دمایی c° 45 تا c° 60 پایدار است. فعالیت سلولیتیک آنزیم پس از نگه داری با یون‏های فلزی کلسیم،پتاسیم ،کبالت، سدیم ومنیزیم افزایش می یابد. در حالیکه در حضور یون های جیوه،سرب، منگنز و روی فعالیت آنزیم به شدت کاهش می یابد. غلظت های افزایشیsds، ?-مرکاپتواتانول،edta ،pmsf و triton x-100 باعث مهار فعالیت آنزیم سلولاز می شود. فعالیت آنزیم در حضور غلظت v/v 20% حلال¬های آلی شامل هگزان، 2-پروپانول، استون و اتانول به ترتیب 110%، 114%، 119% و 128% افزایش می¬یابد. اثر چهار مایع یونی شامل 1- اتیل 3- متیل ایمیدازولیوم برماید، 1- بوتیل 3- متیل ایمیدازولیوم برماید، 1- هگزیل 3-متیل ایمیدازولیوم برماید، ا- بوتیل 3- متیل ایمیدازولیوم کلراید، بر فعالیت آنزیم سلولاز نشان داد که این مایعات سبب کاهش فعالیت آنزیم می¬شوند. برای سوبسترای کربوکسی¬متیل¬سلولز مقادیر سنتیکی km و vmax به ترتیب، mg.ml -11.49 و µm.min-1.mg-1 66.66 است. ژن کدکننده آنزیم سلولاز باکتری bacillus subtilis dr8806 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی لینکردار جداسازی و در وکتور همسانه¬سازی ptz57r/t کلون گردید. پس از تاًیید صحت کلونینگ توسط کلونی pcr، پلاسمیدهای نوترکیب حامل ژن هدف به منظور تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفتند. توالی ژن سلولاز دارای یک قالب خوانش کامل با طول 1500 جفت باز است که یک پیش ساز 499 آمینواسیدی را کد می کند. با توجه به نتایج بدست آمده، آنزیم سلولاز تخلیص شده می¬تواند برای هیدرولیز ترکیبات سلولزی در محیط های قلیایی حاوی حلال های آلی و نیز فرمولاسیون مواد شوینده مورد استفاده قرار گیرد.